以成纖維細胞生長因子為靶標的抑制劑的研究進展

• 2012-08-07
• 專題

哺乳動物成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)家族有18 種成員，它們可以結(jié)合相應(yīng)受體(fibroblast growth factor receptors, FGFRs) 并激活下游信號通路，在胚胎發(fā)生、發(fā)育、血管發(fā)生、血管舒張、神經(jīng)調(diào)節(jié)、缺血保護、創(chuàng)傷愈合和腫瘤發(fā)生等生理和病理過程中起重要作用^[1,2]。現(xiàn)已證實，體內(nèi)FGFs/FGFRs 的過度表達與包括腫瘤(如纖維瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、前列腺瘤、淋巴瘤、白血病、泌尿系統(tǒng)癌等)、骨骼系統(tǒng)疾病(侏儒、顱縫早閉、軟骨發(fā)育不全、黑棘皮癥)和腎衰竭等^[1~6]多種疾病密切相關(guān)。以FGFs或FGFRs 為靶標的抑制劑具有治療與FGF/FGFR 過度表達相關(guān)疾病的潛能，其中PI-88、蘇拉明、PNU145156E 、反應(yīng)停等以 FGFs 為靶標的抑制劑已進入臨床試驗^[1,6~7]。本文對國內(nèi)外近年來以FGFs為靶標的抑制劑的研究進展進行了綜述。

1  糖類抑制劑

肝素和硫酸肝素(HS)對多數(shù)FGFs 的生物活性是必須的：在肝素/HS 和FGF 的共同作用下，F(xiàn)GFR發(fā)生二聚化，繼而觸發(fā)靶細胞對FGF 的一系列反應(yīng)^[1,2,8~10]。肝素和HS都是由兩種相同二糖單元(α-D-氨基葡萄糖(GlcN)(1→4) ?-D-葡萄糖醛酸(GlcA) 和α-D-氨基葡糖(GLcN)(1→4)α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)^[14])聚合而成的氨基葡聚糖(GAGs)。HS結(jié)合FGF 誘導(dǎo)FGFR二聚化需要糖鏈長度的最低值為八糖，長度小于8 并能結(jié)合 FGF 的肝素寡糖一般表現(xiàn)出對FGF 信號的抑制效應(yīng)^[2,11]。有活性的糖類化合物一般都是通過結(jié)合到FGF 的肝素結(jié)合位點而抑制FGF 信號^[7,11]。

1.1 抑制FGF的糖類化合物

已報道的糖類抑制劑多含有L-IdoA的硫酸化低聚糖^[7,12,13]：二糖結(jié)構(gòu)單元為GlcN(2S,6S)(1→4)IdoA (2S)的六糖能強烈抑制FGF-2和其受體的結(jié)合，抑制人動脈平滑肌細胞增殖(IC50為16μg/mL)^[13]；二糖單元為α-D- N -乙酰氨基葡萄糖-(1→4)-α-L-IdoA 的非洲蝸牛粘多糖在體內(nèi)能夠明顯抑制FGF-2 刺激的血管增生，抑制鼠黑色素瘤和肺癌的生長^[14]；4種合成的戊糖(1～4)中，3個糖醛酸殘基全為 L-IdoA 的戊糖1比其它3種戊糖(2～4) 的活性(與FGF-2 的結(jié)合力、抑制 FGF-2和肝素或HS結(jié)合實驗、抑制 FGF-2誘導(dǎo)的人動脈平滑肌細胞的有絲分裂)都要強^[12]。不含有L-IdoA的糖及糖衍生物也可以結(jié)合FGF 并抑制其活性，如未硫酸化的單糖噻唑衍生物 5和6能夠明顯抑制 FGF-2 和肝素的結(jié)合，顯著抑制牛動脈內(nèi)皮細胞的生長^[15]。在和FGF 的結(jié)合過程中糖殘基種類起到主要作用，但帶負電荷的硫酸根也起到促進和增強它們結(jié)合的作用，甚至一些糖失去硫酸根后對 FGF 無抑制作用^[7,11]。過硫酸化的巖藻依聚糖能夠抑制FGF-2誘導(dǎo)的人臍血管內(nèi)皮細胞增殖和血管生成，而脫硫酸的巖藻依聚糖無此活性^[16]。Liu 等^[11]合成出5種α-D-半乳糖(1→4) ?-D-葡萄吡喃甲苷或者?-D-木吡喃糖甲苷的二糖(7～11)，其中化合物7～10和FGF的親和力較強，而R3位無磺酸基的 11 活性遠低于其它二糖。

到目前為止，糖類抑制劑方面最有希望的抗腫瘤候選藥物是硫酸化磷酸甘露戊糖 PI-88(12)，Ⅰ期臨床試驗表明，它有極好的安全性及耐受性^[17~19]，在Ⅱ期臨床試驗中，它輔助治療肝癌切除顯示出良好的抗腫瘤復(fù)發(fā)作用^[17,19]。PI-88的作用機制主要是通過與 HS競爭結(jié)合血管生成因子VEGF、FGF-1和FGF-2，阻斷生長因子與其受體作用，此外它還可以有效地抑制乙酰肝素酶的活性^[17,20]。PI-88對FGF-1和VEGF的結(jié)合力比肝素分別高11倍和3 倍，但是對FGF-2 的結(jié)合力比肝素低13倍^[21]。Karoli 等^[24,25]以PI-88為先導(dǎo)化合物，設(shè)計合成了19種PI-88衍生物，其中13～18也具有很好的活性，與PI-88相比，它們在拮抗乙酰肝素酶活性方面均保持不變，與VEGF、FGF-1、FGF-2親和力活性方面也基本保持不變，但在藥代動力學(xué)方面改變較大，其中1-O-正辛基衍生物(14)的藥代動力學(xué)有很大提高。

1.2 糖-FGF 相互作用的結(jié)構(gòu)分析

通過對肝素衍生低聚糖-FGF^[11]或肝素衍生低聚糖-FGF-FGFR^[9,10,23]的X-晶體衍射結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，肝素衍生低聚糖均是作用于FGF 上帶正電荷的肝素作用位點區(qū)域，因此，糖上的負電荷基團在相互作用過程中起到重要作用。NMR和X 射線晶體衍射分析發(fā)現(xiàn)，肝素和 HS中IdoA殘基上的 2-O-磺酸基以及GlcN殘基上的N -磺酸基是和FGF 作用的主要基團，GlcN中的6-O-磺酸基僅與FGF-1相互作用，不與FGF-2 相互作用^[11,23]。結(jié)構(gòu)單元為 (4-甲基-2-氨基硫酸根合-6-硫酸根合)-α-D-氨基葡糖(1→4)(2-硫酸根合)-α-L-艾杜糖醛酸甲苷的肝素二糖和FGF-1的分子對接數(shù)據(jù)^[11]也證實，糖中磺酸基團和 FGF-1分子中帶正電荷的氨基酸殘基(Lys112、Lys118、Lys113、Lys128、Arg122、Gln127)相互作用。

2蘇拉明類帶負電荷的非糖有機小分子

由于肝素上的硫酸根負電荷在結(jié)合FGF 的過程中起到了重要作用，因此研究者設(shè)計合成了很多帶負電荷的非糖有機小分子抑制劑。

2.1蘇拉明(Suramin)和Suradistas

蘇拉明(19)為一種含有萘磺酸基的對稱分子，是一種抑制 FGF等多種與肝素結(jié)合蛋白的生長因子引發(fā)的血管增生的藥物，可以抑制多種腫瘤細胞的增殖，在臨床上用來治療前列腺癌、膀胱癌等多種腫瘤^[7,24~30]。但是由于其在體內(nèi)的半衰期長(45～55d)，有多個可以作用的靶點，可以抑制一系列重要的酶如DNA聚合酶、蛋白激酶C，和血漿蛋白尤其是白蛋白有高親和力，大劑量使用此藥可以引起凝血紊亂、貧血、腎臟病變，從而表現(xiàn)出比較強的毒性而限制了其臨床應(yīng)用^[7,24~30]。

Suradistas(20～33)為蘇拉明的吡咯和吡唑類衍生物^[29]，Manetti等合成了75個Suradistas類化合物，并對其進行了抑制FGF-2誘導(dǎo)的Balb/c 3T3細胞的有絲分裂和抑制雞胚血管增生等活性篩選。高活性的蘇拉明及Suradistas分子結(jié)構(gòu)特征及其構(gòu)效關(guān)系可歸納為^[7,29~34]：(1)帶負電荷的萘磺酸基團可以和FGF中帶正電荷的堿性氨基酸相互作用；(2)分子內(nèi)兩端的萘磺酸基團間間距大小對其活性來說很重要，PNU145156E(20，n=1)活性最好,22(n=2)活性也很好，而29(n=0)、30(n=3)的活性急劇降低，原因可能是分子內(nèi)萘磺酸基團之間的間距只有處于合適長度時，才可以分別與FGF上的肝素結(jié)合位點和受體結(jié)合位點這兩個帶正電荷氨基酸的結(jié)構(gòu)域作用；(3)分子的剛性共平面的共軛結(jié)構(gòu)對其活性來說是必須的，整個分子為非共軛結(jié)構(gòu)的化合物(32、33)的活性降低甚至消失，原因可能是共軛結(jié)構(gòu)中斷的分子末端萘磺酸基團的擺動自由度增加而導(dǎo)致活性降低。

在Suradistas類化合物中20(PNU145156E)以其高效低毒等優(yōu)點而進入了II期臨床研究^[29,30]。它能夠高效抑制FGF-2誘導(dǎo)的血管增生、M5076 鼠網(wǎng)狀細胞肉瘤、MXT和S180鼠纖維肉瘤等腫瘤的生長，對M5076/CTX和UV2237纖維肉瘤也有抑制作用；它的毒性小于蘇拉明，雖可誘導(dǎo)血小板短暫的降低但無腎毒性^[32,33,36]，具有較好的成藥前景。

2.2  其它萘磺酸類化合物

Carlos 等^[35]對合成的25個氨基萘磺酸類化合物的活性篩選表明，多個化合物(34～43)都能夠明顯抑制FGF-1誘導(dǎo)的Balb/c 3T3細胞的有絲分裂活性，其中以35的活性最好；37 的活性僅次于 35，而且它在其抑制有絲分裂的濃度范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出細胞毒性^[35]。37能夠明顯抑制小鼠局部缺血視網(wǎng)膜疾病中視網(wǎng)膜新生血管的形成^[36]，在0.008~0.08mg/kg劑量范圍可以抑制皮下埋植含F(xiàn)GF-1或FGF-2的明膠海綿誘導(dǎo)的C57/BI/6鼠新生血管形成，8mg/kg時幾乎全部抑制，而蘇拉明和 NTS(44)要起到相同抑制作用，一般要求其濃度大于 200mg/kg^[35]。像蘇拉明一樣，37結(jié)合FGF有可逆性，肝素可以解除其對細胞增殖的抑制活性^[38]。NTS 對FGF-1誘導(dǎo)的血管增生和有絲分裂有高效抑制作用^[7,37]，可以通過提高細胞凋亡抑制兔角膜新生血管生成和神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長^[38]。羊毛鉻黑 T(EBT)(45)在體內(nèi)也有抑制血管增生和腫瘤生長的作用，在細胞周期的S期阻止人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖，其毒性也低于蘇拉明^[7,39]。

2.3  抑制劑-FGF 相互作用結(jié)構(gòu)分析

1H-15N HSQC 核磁共振分析顯示，蘇拉明與hFGF-1的結(jié)合位點分布在肝素結(jié)合區(qū)(Lys127、Tyr139、Lys142)和受體結(jié)合區(qū)(Leu28、Cys30、Gly34、His35) 兩個區(qū)域^[31]。但分子對接研究顯示，肝素結(jié)合區(qū)和受體結(jié)合區(qū)的距離大約是3.2nm ，而1個蘇拉明分子長度是2.4nm ，因此不可能1個蘇拉明分子同時作用在2個位點，而是2個蘇拉明分子同時作用在一個蛋白分子表面^[31]。用等溫滴定量熱法確證，蘇拉明與hFGF-1按照2?1 的比例以高親和力結(jié)合^[31]。分子排阻色譜分析顯示，蘇拉明結(jié)合到 hFGF-1后形成了1個四聚體^[31]。通過穩(wěn)態(tài)熒光檢測的熱去折疊實驗分析顯示，蘇拉明誘導(dǎo)FGF 聚合分為2步^[31]，第1步是2個蘇拉明分子結(jié)合到 1個FGF 上，從而引起了蛋白構(gòu)象的改變，暴露出了蛋白的疏水表面^[31]，隨后，結(jié)合了蘇拉明的FGF 通過疏水表面自動形成1個無活性的四聚體，不能再結(jié)合 FGFR^[31]。

分子對接和分子動力學(xué)實驗[7,30,33,34]顯示PNU145156E 和FGF-1形成1?1的復(fù)合物，通過其萘磺酸基團和FGF-2 上肝素結(jié)合位點(Arg121、Lys126、Asn28) 和受體結(jié)合位點(Arg108) 兩個區(qū)域以氫鍵結(jié)合，另外PNU145156E 上氨基和 Pro133、Gly134通過氫鍵作用。FGF-2 的5 種改構(gòu)體(Cys87羧甲基化，Lys119Gln、Lys125Gln、Lys129Gln、Lys119Gln–Lys129Gln 定點突變 )對PNU145156E 的離解常數(shù)分別提高了12、9.7、9.0、9.1、40.3 倍，而對肝素的離解常數(shù)分別提高了0、10、10、10、和100倍，由此可以說明，PNU145156E 可能通過其分子上的萘磺酸基團結(jié)合于FGF-2 的肝素結(jié)合位點(Lys119、Lys125、Lys129)和Cys87附近的堿性殘基(Arg72、Lys77、Arg81、Lys86)^[29]。

化合物37(5-氨基-2-萘磺酸鈉)和FGF-1 的X 射線衍射晶體數(shù)據(jù)分析表明^[38]，37以1? 1 的比例直接和FGF-1 分子上的肝素結(jié)合位點(Asn32、Lys127、Lys132、Gln141、Lys142)相互作用，前3 個殘基通過氫鍵和磺酸基團作用，后 2 個殘基通過疏水作用和萘環(huán)作用，另外 37 的氨基通過氫鍵和Gly140的羰基作用。NOESY核磁共振分析NTS(44)和FGF-1復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)顯示，負電荷的硫酸根和生長因子上正電荷氨基酸Lys127和Lys142相互作用^[7,37]。

綜上所述，萘磺酸、NTS等小分子均只結(jié)合到FGF 上的肝素作用位點，而蘇拉明和PNU145156E同時和FGF上的肝素作用位點和受體作用位點發(fā)生作用。蘇拉明和PNU145156E是結(jié)構(gòu)很相似的 2種分子，但蘇拉明-FGF-1和PNU145156E-FGF-2的結(jié)合比例分別為2 ?1和1?1，這種不同可能有多方面的原因，比如FGF 種類的不同、測定條件不同或者模型都有待進一步完善。總之，糖類拮抗劑-FGF 相互作用的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)不是很成熟，還有待于進一步深入研究。

3  活性短肽

有關(guān)FGF的肽類拮抗劑報道尚不多，其中大部分都是特異作用于受體(FGFR)膜外部分的短肽拮抗劑^[41~47]。Fan等^[46]應(yīng)用噬菌體篩選技術(shù)篩選到1個活性15肽(PSPVSELSSGRMAYG)，與FGFR1的Ⅱ區(qū)180-182和221-223有同源性，能模擬FGFR1上的FGF-1結(jié)合區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)，與FGF-1上的受體結(jié)合區(qū)域相互作用，抑制FGF-1的促有絲分裂作用。筆者課題組同樣采用噬菌體展示技術(shù)，篩選到與bFGF 具有高親和力和最高特異性的小肽P7(PLLQATL)，其與FGFR2 D3 256～262這段基序具有較高的序列同源性和相似的高疏水性輪廓，可抑制bFGF 誘導(dǎo)的Balb/c 3T3細胞增殖和雞胚CAM血管生成^[47]。

4  其它

反應(yīng)停(thalidomide) (46)是一種II 期臨床用于治療FGF-2 誘導(dǎo)的血管增生抑制劑^[6]，II 期臨床用于治療前列腺癌^[48~51]、腎癌^[52,53]、黑色素瘤^[54]、小細胞肺癌^[55]。能夠顯著降低多發(fā)性骨髓瘤病人血漿FGF-2和VEGF的水平，從而降低病人新生血管的生成，是一種很有希望的治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物^[56~59]。研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)停能夠抑制不依賴于貼壁的U-87 MG和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的生長，而對已經(jīng)敲除FGF-2基因的相應(yīng)的貼壁生長的細胞沒有抑制作用^[60]。因此，其治療腫瘤的機制為：反應(yīng)停能夠和FGF-2的啟動子的富G 區(qū)GC boxes (GGGCGG)^[60,61]和內(nèi)核糖體進入位點相互作用^[61]，因而下調(diào)降低 FGF-2的轉(zhuǎn)錄和

翻譯，降低細胞的FGF-2，從而抑制腫瘤細胞的生長和腫瘤新生血管的形成^[61]。

5  結(jié)語

FGF 的有機小分子和寡糖類抑制劑多數(shù)是通過電荷和FGF 相互作用，因此在體內(nèi)的靶向性相對較差，毒副作用較大，限制了其應(yīng)用^[1,7]。小肽類抑制劑具有用藥劑量小、代謝終產(chǎn)物為氨基酸、毒副作用相對較低等多種優(yōu)點，但小肽類抑制劑在體內(nèi)易受肽酶水解而不穩(wěn)定，從而生物利用度差；小肽的柔性分子結(jié)構(gòu)，可具有多種受體分子識別所需的不同構(gòu)象，從而使它們的選擇性降低，導(dǎo)致藥效差，也會產(chǎn)生一些副反應(yīng)。對短肽進行多種化學(xué)修飾后的物質(zhì)為肽衍生物，這類化合物恰能克服普通短肽的以上缺點，同時又可以兼有普通短肽的優(yōu)點，近年來肽衍生物的研究已經(jīng)成為肽類藥物研究的一個熱點，已經(jīng)開發(fā)出的許多肽類藥物都屬于肽衍生物，比如抗腫瘤藥物奧曲肽等。因此，如果把噬菌體展示技術(shù)篩選出來的FGF 拮抗活性小肽改造為肽衍生物，將有可能發(fā)現(xiàn)高效低毒的FGF 抑制劑類候選藥物。由于已報道的FGF 抑制劑基本多是未經(jīng)過分子對接等藥物設(shè)計過程就直接憑經(jīng)驗進行合成和藥理研究，所以將來在進行FGF 抑制劑類藥物設(shè)計時，應(yīng)該充分利用計算機輔助藥物設(shè)計等現(xiàn)代藥物設(shè)計手段，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有機小分子抑制劑、寡糖類抑制劑和短肽抑制劑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上綜合分析，設(shè)計新的先導(dǎo)化合物。

由于已經(jīng)確證的多種腫瘤、骨骼系統(tǒng)疾病和腎衰竭等都和體內(nèi)多種FGF 過度表達有關(guān)^[1~7]，因此對FGF 抑制劑的研究將成為治療這些疾病的一個重要方向。然而，到目前為止，F(xiàn)GF 抑制劑的研究主要還是集中在FGF-1 和FGF-2 上，對其它的FGF 的抑制劑的研究不多；盡管已經(jīng)有應(yīng)用于臨床治療研究的FGF 拮抗劑藥物，但是還未發(fā)現(xiàn)很理想的高效低毒拮抗劑藥物。這一切都預(yù)示著對FGF 抑制劑類藥物的研究有著非常廣闊的空間和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

參  考  文  獻

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 注：本文為提供者整理翻譯的，由于知識所限，錯誤在所難免，敬請原諒。如有問題可以查找原文。