磁性粒子在蛋白質分離純化中的應用

• 2012-04-17
• 專題

早在20世紀40年代，磁性氧化鐵就被用于吸附和去除溶解在廢水中的膠狀物。20世紀70年代，Robins等¹⁾首次將磁性粒子用作固定化酶的載體。此后，又將其用于選擇性捕獲生物分子，利用表面帶有氨基的硅烷化磁性粒子從大腸埃希氏菌中分離純化了B2半乳糖有²⁾。隨后的20年間，磁性粒子用于生物分子分離的研究發展緩慢。進入21世紀，將磁性粒子作為吸附劑直接從生物樣品中分離生物分子引起了廣泛關注，對磁性粒子的研究日益活躍，相關的文獻報道迅速增加。并目，Chemagen、Micromod、Dynal等一些公司己推出了性能良好的商品化磁性粒子。日前，磁性粒子的應用己擴大到生物大分子(如蛋白質、核酸)分離、靶向藥物、免疫分析、細胞標記和細胞分離以及環境監測等領域。

近年，隨著蛋白質組學研究的快速發展，磁性粒子用于蛋白質分離純化的研究發展迅速，其在解決蛋白質快速分離和高特異的選擇性分離方面，具有高效、快速的優勢。磁性粒子用于蛋白質分離是指以納米或微米級的磁性材料為載體，通過對此磁性載體的表面進行修飾，使其能夠特異性吸附目標蛋白質，進而在外加磁場的作用下實現與原樣品溶液組分快速分離。分離后的磁性粒子再經過清洗、解吸附等操作即可得到目標蛋白質。此法具有分離方法與設備簡單、操作方便快捷、處理樣品量大、分離的選擇性與特異性好、純度與回收率高等優點。本文綜述了2005年以來有關磁性粒子在蛋白質分離純化中的研究進展。

1磁性粒子與磁性分離的特性

磁性粒子是指因含有磁性金屬或金屬氧化物(如Fe、Co、Ni及其氧化物)的超細粉末而具有磁響應性的粒子。磁性粒子一般為核硫型結構，以含磁性材料的超細粉末組成核，核外層的功能高分子材料組成殼層:或者以功能高分子材料為核，核外層包覆的磁性材料作殼層:也可做成夾心結構，外、內層均為功能高分子材料，中間層為磁性材料:還有混合型，即由磁性材料和功能高分子材料混合而成的多核結構^3-5)。由于磁性物質中的Co、Ni表現出很強的生物毒性和化學不穩定性，其應用范圍受到限制；日前應用最多的磁性材料是Fe₃O₄，其穩定性較好，對生物體的毒害作用小，目制備方法簡單，粒度、形狀和組成可通過合成條件加以控制。

將磁性粒子用于蛋白質的分離純化最好選擇穩定性好、有一定生物相容性的磁性材料。使用的磁性粒子需要具有以下特性：(1)良好的表面效應和體積效應。隨著粒子比表面積的增大，粒子表面的官能團密度增大，選擇性吸附能力增強，因而達到吸附平衡的時間縮短，粒子的穩定性大大提高；(2)磁響應性。磁性粒子具有超順磁性，在磁場中有較強的磁性，去掉磁場后磁性很快消失，在磁場中不被永久磁化故可在外加磁場(如磁鐵)作用下，快速、方便地分離目標組分；(3)生物相容性。磁性粒子用于生物工程，特別是生物醫學工程時，需要具有良好的生物相容性。磁性粒子表面包覆的高分子材料多數為如多聚糖、蛋白質、脂類等生物高分子具有良好的生物相容性，在人體內安全無毒，可降解不與人體組織器官產生免疫抗原性；( 4)表面可修飾。磁性粒子通過表面化學修飾或改性，形成帶有特定功能基團或配基的殼層，能與目標蛋白質可逆性結合。從物理學角度看，Franzreb等⁶⁾認為磁性載體粒子用于分離純化蛋白質應考慮如下因素：(l)粒子的孔徑大小不足以使目標生物分子滲入；(2)擁有高特異性的表面積(20~100 m²/g)；(3)尺寸具有單分散性；( 4)在中低強度的磁場下能夠很容易地被分離。

磁性分離的方法簡單，可直接從原始樣品中對目標蛋白質進行分離。針對目標蛋白質對磁性載體進行修飾后，將磁性粒子直接放入含有目標蛋白質的混合溶液中，表面的功能高分子材料通過離子交換作用、親和作用或印跡位點等對蛋白質進行選擇性吸附，吸附平衡后，利用外加磁場實現分離。整個分離過程在一個容器中進行，僅需根據高分子材料的特點及其與蛋白質間的不同作用方式對混合溶液的pH、溫度、離子強度等進行調整，減少了傳統分離方法如鹽析、有機溶劑沉淀法中蛋白質的損失⁷⁾。磁性分離無需離心、過濾、色譜分離等操作，省去繁瑣的樣品預處理和樣品分離過程；磁性粒子對蛋白質具有獨特的吸附性能，用磁性粒子分離純化蛋白質能用于任何下游操作的過程。與傳統分離方法比較，蛋白質的磁分離具有快速、高效、高收率等優點。

2磁性粒子的表面修飾

磁性粒子用于蛋白質分離是基于在磁性粒子表面上修飾離子交換基團或親和配基等可與目標蛋白質產生特異性吸附作用的功能基團，使經過表面修飾的磁性粒子在外加磁場的作用下從生物樣品中快速選擇性地分離目標蛋白質。因此，針對目標蛋白質選擇適合的功能基團并對磁性載體表面進行修飾是選擇性分離的關鍵。日前報道的表面修飾基團主要是陰、陽離子交換基團和親和配基。表面修飾離子交換基團的磁性粒子較修飾親和配基的磁性粒子應用更為廣泛，但對目標蛋白質的選擇性較差，其對帶電性質相反的蛋白質均有靜電吸附作用，非特異性吸附較為明顯。表面帶有親和配基的磁性粒子對目標蛋白質有很高的特異性吸附，針對目標蛋白質的分離和純化更有價值，但日前己知可用的親和配基種類有限，目價格昂貴，使針對大量目標蛋白質的分離受到限制。

2.1.1修飾離子交換基團

利用陰、陽離子交換基團修飾磁性載體表面，使其表面具有荷電性。表面功能化的磁性粒子能夠通過靜電作用吸附帶有相反電荷的蛋白質，繼而通過磁場分離、清洗和解吸附步驟，實現樣品中目標蛋白質的選擇性分離。常用的陰離子交換基團有COOH，SO₃^-，陽離子交換基團有NH2、N(CH₂CH₃)₂。經離子交換基團衍生得到的磁性粒子有很好的純化性能，其中，COOH和SO₃^-可與表面帶正電的蛋白產生吸附。利用SO₃^-能從復雜的天然乳清樣品中純化重要的乳鐵傳遞蛋白⁸⁾；L iao等^9、10)制備了離子交換效率高、吸附解離速度快的核殼型新型磁性納米吸附劑Fe₃O₄/PAA聚內烯酸)，基于靜電吸附原理成功分離子水相中的菠蘿蛋白酶^11、12)；Bucak等¹³⁾利用磷脂包裹的磁性納米顆粒的表面負電性選擇性地分離子帶有正電荷的蛋白質，吸附容量比商業化吸附劑的高出1個數量級，目沒有傳統多孔離子交換介質的擴散阻力:表面帶有)COOH的磁性聚(甲基內烯酸縮水甘油醋卻基內烯酸甲醋)微球對胰島素的吸附容量為12312mg/g 且能保持其良好的生物活性¹⁴⁾。NH₂和N(CH₂CH₃)₂與表面帶負電的蛋白有吸附作用，Sivagnanan等¹⁵⁾首次通過靜電作用，將蛋白質功能化的磁球固定在修飾帶正電的氨基硅烷的玻璃平板上形成微圖形，該技術有利于在芯片上進行生物分子鑒定。修飾離子交

換基團的磁性粒子對不同等電點的蛋白質具有較好的分離效果。日前報道的研究主要是基于陰離子交換基團修飾的磁性粒子，陽離子交換基團修飾的較少，這可能與目標蛋白質的帶電性質有關，報道的乳鐵傳遞蛋白與菠蘿蛋白酶的pH均大于7,而常見的溶菌酶、細胞色素C等蛋白質也均為堿性蛋白質，其在常規實驗條件(pH約為7)時均帶正電荷。

2.1.2修飾親和配基

在磁性粒子表面修飾與目標蛋白具有特異性結合作用的親和配基，經過親和吸附、磁場分離、清洗和解吸附等操作可從樣品中高選擇性地分離目標蛋白。日前常見的用于磁性粒子表面偶聯的親和配基有：表面具有一價金屬離子的亞氨基二乙酸(IDA)及次氮基二乙酸(NTA) ,鏈霉親和素、生物素和蛋白A或G等，這些配基對細胞組織勻漿液等復雜樣品中的目標蛋白具有很好的選擇性。不同親和配基功能化的磁性粒子適合分離不同的目標蛋白。

像IDA和NTA這樣的親和配基價廉A結合牢固，在實驗中應用較多^16-19)。IDA和N TA等通過其二價金屬離子(Co²⁺、Zn²⁺, Ni²⁺或者Cu²⁺)對表面暴露有半膚氨酸殘基、色氨酸殘基、特別是組氨酸殘基的蛋白質有很好的親和作用。Karatas等²⁰⁾基于免疫球蛋白G表面帶有的大量組氨酸殘基能夠與過渡金屬相互作用，用金屬鰲合的磁性粒子從人血液中親和去除免疫球蛋白G，其吸附的最大量達10211mg/g。Taton等²¹⁾利用水溶性磁性納米顆粒表面的羧基，共價交聯DA進而固定Cu²⁺，最后實現了對組氨酸標記的蛋白質的捕獲。Kin等Cu²²⁾使用Ni ₂NT'A功能化的磁性瓊脂糖球原位分離組氨酸標記的蛋白質，為重組蛋白的快速分離純化提供了一種方法。

磁性粒子表面偶聯的鏈霉親和素對生物素化蛋白有較高的結合容量:表面偶聯的生物素和蛋白A或G等親和配基分別對帶有鏈霉親和素化蛋白和單克隆抗體的親和性較好。日前，這些帶有親和配基的功能化磁性粒子都己實現商品化，但是價格昂貴。文獻中報道的鏈霉親和素功能化的磁性粒子也多是商品化產品，它能親和固定生物素梭基載體蛋白²³⁾和生物素化的寡核有酸²⁴⁾，并從混合樣品中加以分離。磁性粒子表面修飾葡萄球菌ProteinA，其與人IgG抗體的結合量為15~18mg/g能有效分離人抗血清樣品中的IgG抗體²⁵⁾。另外，表面偶聯甲氨蝶吟的磁性粒子，對二氫葉酸還原酶與脫氧胞有激酶有很好的親和特性與商品化的磁性載體相比對蛋白質沒有非特異性鍵合²⁶⁾。

3磁性粒子在蛋白質分離純化中的應用

3.1.1對標準蛋白與修飾蛋白的分離純化

當前，研究報道中涉及磁性粒子分離純化蛋白的數量和種類比較集中，所用的蛋白主要為常規實驗用蛋白、糖基化蛋白和磷酸化蛋白。多數報道是關于磁性粒子的基質、間隔基和配體等對分離性能的影響以及實驗條件和吸附容量的研究。

3.1.2.1實驗用標準蛋白的分離      牛血清白蛋白(BSA)^18,27,28)、牛血紅蛋白(BHb)^16,17)、免疫球蛋白^20,25)、溶菌酶^9,29,30),組氨酸標記的蛋白^21,22)等常用蛋白作為模型蛋白研究磁性粒子分離純化的工作較多。磁性粒子用于蛋白質分離純化過程當中其制備方法、基質選擇、表面修飾基團與粒徑大小的不同都會造成對相同蛋白質吸附量的差別。

以分離純化BSA為例，采用模板法制備單分散磁性硅膠微球，表面修飾IDA- Cu²⁺的磁性固定化金屬親和純化載體，對BSA的飽和吸附量為90mg/g¹⁸⁾；Yang等制備的粒徑為212Lm的磁性粒子對BSA的吸附容量為70mg/g²⁷⁾；采用反相懸浮包埋法制備的小粒徑(有效粒徑為56119rnn)殼聚糖磁性微球經戊二醛活化后對BSA的飽和吸附量為4613mg/g經Cibacron Blue 3G2A修飾后對BSA的飽和吸附量為6612mg/9²⁸⁾；磁性殼聚糖納米粒子對BSA吸附符合Langmuir吸附模型，吸附容量為250mg/g堿性條件下能實現解吸附³¹⁾；以具有熱敏性的N-異異丙基丙烯酞胺包裹磁性納米顆粒，通過改變溫度控制吸附或者解離可實現BSA的分離³²⁾。

因磁性粒子的制備方法與粒徑大小不同，對BHb進行親和分離純化時，同樣在表面引入IDA₂Cu²⁺親和配基，而對BHb的吸附量分別為316mg/g¹⁶⁾和 543mg/g¹⁷⁾；因磁性粒子表面基質選擇的不同，疏水親和配體L2色氨酸固定的磁性聚(甲基丙烯酸縮水甘油醋)微球³³⁾和染料固定的磁性聚(甲基丙烯酸2羥乙基醋)微球³⁴⁾可以實現蛋清中溶菌酶的分離純化，對溶菌酶的最大吸附容量分別是25916和342mg/g，對組氨酸標記的蛋白而言，Hung等³⁵⁾制備的過渡金屬離子功能化的磁性粒子，能特異性結合組氨酸標記的貢組蛋白，可用來預測組氨酸標記的綠色熒光蛋白吸附到Fe₃O₄磁性納米粒子表面的空間排列，并可直接從細胞溶解液中分離綠色熒光蛋白，最大吸附容量達865mg/g NTA-磷脂膠束包覆的功能化磁性納米粒子，也可結合組氨酸標記的熒光蛋白，吸附容量為900-1100mg/g是商品化磁性球吸附容量的100倍³⁶⁾。

Chen等³⁷⁾將表面硅烷化的磁性氧化鐵粒子作為表面輔助激光解吸附/離子化質譜的輔助材料，即將帶負電荷的硅烷化磁性粒子用作親和探針，通過調整溶液pH，從水溶液中富集微量帶正電荷的細胞色素C和肌血球素，可用來分析富集小蛋白和氨基酸，最高檢測質量近似為16kD，對氨基酸檢測限大約為20 fnol。Yao等³⁸⁾利用C₈修飾的表面功能化磁性納米粒子，快速從胰蛋白酶解產物和人血清中富集低豐度膚，并在磁性粒子上直接經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI2TOF2MS)對富集的目標物進行分析。Jiang等³⁹⁾用剛性單分散的磁性粒子對C2球蛋白進行吸附分離，吸附容量達到28712mg/g

3.1.2.2對糖基化、磷酸化蛋白的分離    隨著對蛋白組學研究的深入展開，磁性粒子也應用于具有重要生理功能的翻譯后修飾蛋白，糖基化蛋白和磷酸化蛋白的分離鑒定中。已有將凝集素、硼酸等鍵合到磁性粒子表面對糖蛋白或糖膚進行分離富集的報道⁴⁰⁾。Katrm等⁴¹⁾將功能化磁性球與質譜技術聯用，縮短了分析過程的時間，提高了分辨率，實現了自動化。他們分別用伴刀豆球蛋白A，硼酸和麥牙凝集素功能化的磁性微粒子富集糖基化的人血清蛋白。這些功能化磁性球對不同的糖基化蛋白有特異性鍵合，MALDI2TOF2MS分析檢測到血清蛋白中8種低豐度的糖蛋白。用間氨基苯硼酸功能化磁性球對糖蛋白進行簡單的處理和富集后，MALDI2TOF2MS可直接測定磁性球上糖蛋白的含量并對其加以識別和確認⁴²⁾。Zou等⁴³⁾將磁性粒子用于固相萃取糖蛋白(SPEG)的分析中。表面帶有酞肼基的超順磁性二氧化硅粒子用作微孔平板SPEG的固定基質，其對糖蛋白的吸附容量是36mg/g是傳統商品化微球的5倍，能特異性、可重復地對糖蛋白進行高通量的分離。由于糖蛋白質組學極其復雜，將磁性粒子用于糖蛋白研究，實現糖蛋白或糖膚的選擇性富集具有重要意義。

此外，基于金屬氧化物對磷酸化蛋白或膚段也具有富集效果，通過改變磁性粒子的性能，在磁性粒子表面包覆金屬氧化物，就可在實現富集的同時，也使操作過程更為簡便有效，如用Al₂O₃、ZrO₂、TiO₂等包覆的磁性粒子在磷酸化蛋白或膚段的富集方面取得了一定的成效^44,45)。Lo等⁴⁶⁾將ZrO₂包覆的氧化鐵磁性粒子作為親和探針，無需脫鹽，就能直接從胰蛋白酶解產物中選擇性富集磷酸膚。除用金屬氧化物包覆磁性粒子外，也有少數使用金屬磷化物如ZrP⁴⁷⁾包覆磁性粒子實現磷酸化蛋白的分離和富集的報道。

3.1.2磁性分離的新方法

把磁性分離與其它分離純化技術結合，有利于提高蛋白質分離的選擇性及拓寬目標蛋白的種類，提高分離效率。磁性分離與分子印跡結合、磁性分離與雙水相萃取等結合有望在蛋白質分離純化應用中發揮更大的作用。

3.1.2.1.1磁性分子印跡材料    分子印跡技術是近年來基于分子識別理論而迅速發展起來的一種新型高效分離技術，日前己廣泛用于乎性拆分、生物傳感器、分離純化等領域。當使用特殊的功能聚合物分子印跡聚合物包裹磁性粒子時，可形成表面具有分子印跡的磁性材料，通過印跡位點、形狀、官能團的互補作用能夠更方便地分離和富集模板分子，用于蛋白質的分離純化。該方法操作簡單、選擇性高，有望成為分離純化特定蛋白質的強有力工具。

Lu等^48,49)在使用反相懸浮聚合法制備分別以牛血清白蛋白和溶菌酶為模板蛋白的印跡聚合物的過程中，加入Fe₃O₄作為磁性成分，得到了蛋白質印跡的濕軟凝膠復合磁性微球。觀察環境掃描電鏡(ESEM)和掃描電鏡(SEM )圖發現，得到的印跡聚合物均為球形，濕態下有大量分布規則的孔。蛋白質印跡的磁性微球內Fe₃O₄的平均含量為2108(wt)%，在外加磁場的作用下，牛血清白蛋白和溶菌酶為模板蛋白印跡的微球均有一定的磁響應，對自身的模板分子有良好的識別選擇性，各自的分離因子為4175和5188。印跡的磁性微球對模板蛋白的識別選擇性主要依賴于互補產生的大量氫鍵隴同作用和蛋白質外表面與印跡孔穴內表面緊密的結合。當完成特異性吸附與識別之后，蛋白印跡的磁性微球能簡單、快速地從體系中分離出來。Chau等⁵⁰⁾用微乳液聚合法成功制備了核糖核酸酶A印跡的亞微米粒子，形狀規則，粒徑為700-800nm。納米級Fe₃O₄粒子被包裹在印跡粒子內部，包裹率較高達到1715%，使得印跡粒子具有超順磁性。在水溶液中，它能優先吸附模板蛋白，與非模板蛋白相比，印跡粒子對模板蛋白具有高選擇性，吸附容量達到12717mg/g。鑒于蛋白質體積龐大、易于變性、印跡困難的事實，Chau等⁵¹⁾又提出了一種適合蛋白質印跡的方法：共價固定模板分子的表面印跡法，并制備了牛血清白蛋白表面印跡亞微米磁性粒子。該粒子的結構與血紅細胞類似，在水溶液中對模板蛋白具有非常好的識別性能。粒子內部成功包覆的Fe₃O₄納米粒子使其具有磁性，這種超順磁性增加了其在磁生物分離等方面的應用。而目，模板蛋白固定對蛋白質的成功印跡是十分重要的，它將有望成為一種普適性蛋白質印跡法。He等^52,53)在磁性粒子與分子印跡技術結合方面也做了較多的研究，采用溶膠凝膠法制備表面包覆硅的Fe₃O₄磁性納米粒子，進而在模板蛋白的存在下，合成了平均粒徑210nm的核殼結構牛血紅蛋白印跡磁性納米粒子。蛋白吸附結果表明，該磁性納米粒子對模板蛋白具有高吸附能力和相對低的非特異性吸附目易達到吸附平衡在外加磁場作用下容易實現磁性分離。

3.1.2.1.2磁性分離洲水相萃取聯用    雙水相萃取作為一種獨特的可保持生物活性的液液萃取分離技術，用于特定蛋白質的分離分配行為研究較多。近3年來，雙水相萃取用于蛋白質組學研究開始得到關注^54-58)。將磁性吸附劑與雙水相體系結合，用于純化和富集蛋白質是液固吸附、液液萃取和磁性分離二者的結合，日前有關報道不多。

Becker⁵⁹⁾通過磁性吸附劑與雙水相體系的結合，實現了親水性蛋白的純化和富集。體系溫度的變化，使非離子表面活性劑Triton X2114的水溶液分離成共存的兩相，形成雙水相體系。其中，一相富含表面活性劑，另一相含量較少。在雙水相體系中，親水蛋白通常在表面活性劑較少的相中的分配系數較大。當將磁性吸附劑引入雙水相后，兩相對親水蛋白的選擇有了明顯的變化。磁性吸附劑吸附目標蛋白后，使其從表面活性劑較少的相進入富含表面活性劑的相。體系中，溶菌酶(pI>1015)和卵清蛋白(pI<514)的起始濃度比是1 ：1，溶液pH為618，加入磁性陽離子交換吸附劑，溶菌酶通過靜電相互作用吸附在磁性球表面，使得溶菌酶分配行為被改變，在富含表面活性劑的下相產率達74%，純凈度超過80%。不斷增加體系的離子強度，吸附的溶菌酶從磁性吸附劑上解吸附下來，從而產生一個可調控的萃取體系。該方法可用于親水性蛋白的分離。磁性粒子與雙水相萃取結合也將是雙水相萃取自身發展的突破點，兩者結合可以加速相分離，提高生產能力⁶⁰⁾。

4結語

目前磁性離子的應用主要集中于細胞分離與核酸純化研究，而對蛋白質的磁性分離應用相對較少。由于磁性粒子的材料、磁響應性、粒子形狀與粒徑、尤其是經過表面修飾的特異性吸附表面是大規模進行蛋白質分離純化的關鍵，因此，磁性粒子在蛋白質分離純化的廣泛應用依賴于吸附容量高、選擇性好、可重復使用、價格便宜的磁性材料的高效制備。

當前，磁性粒子針對蛋白質的分離研究大都局限在簡單體系中對標準蛋白質純品吸附的實驗條件和吸附容量測定等方面，目蛋白的研究種類集中在某些常見實驗用標準蛋白，對復雜體系的研究相對較少。然而，實際生物樣品的組成極其復雜，蛋白的種類和數量繁多，因此應進一步開展實際樣品中對特定的重要蛋白質的分離純化的方法研究，如利用磁性分離針對高豐度蛋白和低豐度蛋白建立選擇性富集和去除的快速方法，解決蛋白組學研究中的實際問題。

功能化磁性粒子及磁性粒子與其它分離技術(如雙水相萃取、分子印跡技術等)的結合在蛋白質和其它生物物質分離中具有潛在的應用前景，它們各自優勢和特點的結合有望發展成具有集成化優勢的分離技術。隨著智能高分子材料的深入研究^32,61-64)，將磁性粒子與對外界環境(如溫度、pH、離子強度、光等)敏感的智能高分子材料結合，有望合成智能型磁性粒子，其在蛋白質等生物分子分離中的應用也將是未來磁性粒子發展的方向。

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注：本文為提供者翻譯的，由于知識所限，其中錯誤在所難免，敬請原諒。如有問題可以查找原文。